KOPĪGOT | DRUKĀT | SŪTĪT E-PASTU
Es vēlos sākt ar atgādinājumu, kas publiskās diskusijās bieži vien pazūd: Covid mRNS vakcīnas ir patiesi jauni medicīnas produkti.
Pirms ārkārtas atļaujām 2020. gadā mRNS vakcīnas tehnoloģija nekad nebija plaši izmantota cilvēku ārstēšanā. Tikai divos klīniskajos pētījumos, vienā no Pfizer-BioNTech un vienā no Moderna, šī platforma jebkad bija pārbaudīta cilvēkiem. Kopumā medicīnas vēsturē aptuveni 37 000 cilvēku jebkad bija saņēmuši mRNS vakcīnu (neskaitot iepriekšējo pieredzi ar trakumsērgas, CMV un vēža vakcīnām, kas aprobežojās ar daudz mazākiem agrīnās fāzes pētījumiem). Tā nav kritika; tas ir vienkārši fakta konstatējums. Taču tas nozīmē, ka šo produktu ilgtermiņa drošības profils bija un joprojām ir nepilnīgi izprasts.
Turpmākais ir pazīstams gandrīz visiem molekulārbiologiem. Tas ir sarežģīti, bet, ņemot vērā likmes, es cenšos to vienkāršot. Ir svarīgi skaidri izklāstīt molekulāro struktūru ikvienam, jo tas, kā šīs vakcīnas tiek ražotas, tieši nosaka, kas atrodas flakona iekšpusē.. Un tas, kas atrodas flakona iekšpusē, pēc injicēšanas izplatīsies pa visu ķermeni un aktivizēs notikumu kaskādi, kas var izraisīt ilgtermiņa sekas veselībai.
In vitro transkripcija nav tikai ražošanas detaļa
Modificētas mRNS vakcīnas tiek ražotas, izmantojot procesu, ko sauc par in vitro transkripciju (IVT)IVT ir metode, ko izmanto, lai sintezētu modificētu mRNS, kas galu galā kļūst par vakcīnas aktīvo vielu.
Šī nav vienkārša tehniska detaļa. IVT būtiski ietekmē gala produkta molekulāro sastāvu.
BioNTech zinātnieki, tostarp tie, kas tieši iesaistīti Pfizer vakcīnas izstrādē, ir publicējuši detalizētu pārskatu.1 apraksta, kā IVT reakcijas ģenerē ne tikai paredzēto pilna garuma mRNS, bet arī virkni blakusproduktu un piemaisījumu, kā tie parasti tiek noņemti un kādas var būt to bioloģiskās sekas, ja tie saglabājas. Šos ražošanas virzienus kopā ar to radītajiem blakusproduktiem savos patentos (US10 653 712 B2 un US10 077 439 B2) detalizēti aprakstīja arī Moderna. Bet vēl svarīgāk ir tas, ka šī molekulārā bioloģija bija labi izveidota ilgi pirms Covid. Nekas no tā nav spekulatīvs.
Izejmateriāls: DNS veidnes
Pēc būtības IVT reakcija sākas ar divpavedienu DNS, kas kodē vēlamo olbaltumvielu. Šajā gadījumā tas ir SARS-CoV-2 vīrusa tapas proteīns.
mRNS vakcīnās izmantotā tapas kodēšanas secība ir ģenētiski modificēts lai uzlabotu stabilitāti un šūnu toleranci, tostarp divas aminoskābju aizvietošanas, kas to atšķir no vīrusa smailes. Šī modifikācija ir tīšs.
Pati DNS matrica var pieņemt dažādas formas. Pfizer agrīnajos klīniskajos pētījumos tika izmantoti ar PCR ģenerēti DNS fragmenti. Tomēr komerciālais ražošanas process balstījās uz no plazmīdām iegūto DNS. Tas ir svarīgi, jo plazmīdas satur papildu regulējošās sekvences. Pfizer gadījumā tās ietver tādus elementus kā SV40 promotors un ori sekvences, kas rada bažas, ja tās nonāktu cilvēka šūnās.
Kad šī DNS veidne ir pievienota IVT reakcijai kopā ar RNS polimerāzi un citiem komponentiem, tā tiek transkribēta mRNS (1. attēls).
IVT ražo blakusproduktus pēc dizainaLai gan vēlamais IVT rezultāts ir paredzētais pilna garuma mRNS produkts, faktiskais rezultāts ir sarežģītāks. Tie ietver dažādus blakusproduktus (1) dažādu RNS sugu veidā, tostarp divpavedienu RNS (dsRNS), (2) pie RNS pievienotas DNS (RNS-DNS hibrīdi) un (3) brīvās DNS no sākotnējās matricas (2. attēls).
Šo blakusproduktu veidošanās ir labi dokumentēta un neizbēgama, un tāpēc tālāka attīrīšana ir absolūti nepieciešama drošības nolūkos.
2. attēls. IVT ražošanas blakusprodukti un piesārņotāji. Attēls pielāgots no 1.Attīrīšanai ir zināmi ierobežojumi
Pēc ražošanas ir nepieciešami divi attīrīšanas soļi, lai vispirms atdalītu DNS un pēc tam RNS blakusproduktus (3. attēls):
3. attēls. IVT blakusproduktu noņemšana. Attēls pielāgots no 2.Lai atdalītu DNS, reakcijas maisījumam pievieno enzīmu, ko sauc par DNāzi I, ko parasti izmanto piesārņojošās DNS noārdīšanai. Lai gan DNāze I ir efektīva pret brīvo matricas DNS, vairāki pētījumi, tostarp pašu BioNTech zinātnieku darbs, liecina, ka DNāze I nav efektīva RNS (RNS-DNS hibrīdu) piestiprinātās DNS noņemšanā.
Šis ierobežojums nav pretrunīgs. Tas ir dokumentēts literatūrā.
Ko parādījušas neatkarīgas analīzes
Šis konteksts ir ļoti svarīgs, lai interpretētu nesen veiktās neatkarīgās gatavo vakcīnu flakonu analīzes.
pētnieki3 un regulatori4 ir ziņojuši par DNS piesārņotāju atklāšanu praktiski katrā testētajā flakonā. Šie piesārņotāji ietvēra gan divpavedienu DNS, gan RNS-DNS hibrīdus, kas šķita rezistenti pret DNāzes I sagremošanu.
Dažos paraugos tapas kodējošās DNS bija vairāk nekā 100 reizes augstākā līmenī nekā citās plazmīdu sekvencēs.5, kas liecina par nevienmērīgu vai nepilnīgu gremošanu. Sekvencēšanas un kvantitatīvās PCR analīzes papildus atklāja DNS fragmentus, kuru vidējais garums bija ~200 bāzes pāri, daži pārsniedza 4 kilobāzes. Vairākos gadījumos tika novērotas sekvences, kas aptver gandrīz visu plazmīdu.
Kopumā šie atklājumi rada nopietnus jautājumus par attīrīšanas konsekvenci un pilnīgumu liela mēroga ražošanas laikā, kā arī par atlikušo nukleīnskābju iespējamām bioloģiskajām sekām cilvēkiem.
Kāpēc nukleīnskābju piesārņotāji ir bioloģiski svarīgi
RNS un DNS ir spēcīgi iedzimto imūnsistēmas ceļu aktivatori. Tas nav spekulatīvi. Rakstu atpazīšanas receptori un cGAS-STING ceļš spēcīgi reaģē uz svešām nukleīnskābēm, izraisot iekaisumu, augšanas inhibīciju un pat šūnu nāvi.
Tieši šo mehānismu dēļ gēnu terapijas produkti tiek pakļauti stingrai drošības uzraudzībai.
Ironiski, ka Covid mRNS vakcīnas tika izstrādātas ar modifikācijām, kas īpaši paredzētas šīs spēcīgās iedzimtās imūnās aktivācijas mazināšanai. Taču RNS-DNS hibrīdi un DNS fragmenti joprojām izraisīs spēcīgu imūnreakciju, neskatoties uz šīm modifikācijām.
Neatlaidība rada jaunus jautājumus
Tagad ir iegūti būtiski pierādījumi, kas liecina, ka smailes mRNS un proteīns cilvēka audos saglabājas nedēļas, mēnešus un pat gadus pēc vakcinācijas (1. tabula).
Mēs vēl nezinām, vai šī noturība atspoguļo ilgstošu mRNS stabilitāti, nepārtrauktu translāciju vai uz DNS balstītus mehānismus. Taču, ņemot vērā DNS integrācijas ticamību un ilgstoši dzīvojošu neintegrētu plazmīdu DNS muskuļu šūnās,6 Nav nepamatoti pieņemt, ka Spike mRNS, olbaltumvielu un antivielu noturība pret Spike vairākus gadus pēc vakcinācijas nav saistīta ar DNS piemaisījumiem un blakusproduktiem pēc IVT.
1. tabula. Smailes mRNS un olbaltumvielu noturība pēc vakcinācijas cilvēkiemĪstermiņa un ilgtermiņa drošības ietekme
Kopumā šie dati rada vairākus svarīgus drošības apsvērumus.
Pirmkārt, tūlīt pēc vakcinācijas ir ziņots par akūtām imūnreakcijām, tostarp citokīnu vētrām un anafilaksi. Šādas spēcīgas iekaisuma reakcijas nevajadzētu pilnībā noraidīt kā nesaistītas ar piemaisījumiem, jo īpaši ņemot vērā to, kas ir zināms par nukleīnskābju izraisītu imūnaktivāciju.
Otrkārt, un vēl svarīgāk, ir ilgtermiņa riski. Pastāvīga tapas ekspresija varētu veicināt hroniskus imūnsindromus. Vēl satraucošāka ir DNS integrācijas iespējamība, kas rada insercijas mutaģenēzes vai gēnu darbības traucējumu riskus. Tas nozīmē vēža vai attīstības defektu risku atkarībā no tā, kur un kādā vecumā DNS tika integrēta.
Jāatzīmē, ka pati FDA savās informatīvajās lapās norāda, ka šīs vakcīnas nav... ir novērtēta kancerogenitātes (vēža veidošanās) vai genotoksicitātes (DNS bojājumi) ziņā, kas būtu ikdienišķa un sagaidāma prakse gēnu terapijas uzraudzībā, kur ilgtermiņa uzraudzība ir standarta procedūra.
Regulējuma nepilnības attiecībā uz DNS mRNS vakcīnās
Tā kā vairs nav strīda par to, ka mRNS vakcīnās ir atlikušās DNS, jautājums ir par to, vai pašreizējās vadlīnijas un drošības ierobežojumi ir atbilstoši mRNS vakcīnām. Mums ir apliecināts, ka DNS blakusprodukti atbilst normatīvajās vadlīnijās noteiktajām robežvērtībām. Tātad, kādas ir Pārtikas un zāļu pārvaldes (FDA) vadlīnijas attiecībā uz DNS blakusproduktiem un piesārņotājiem?
Visbiežāk citētās FDA vadlīnijas par atlikušo DNS (≤10 ng uz devu) tika izstrādātas vīrusu vakcīnām, kas ražotas dzīvās šūnās, kuras ir fragmentētas un "kailas", ar ierobežotu spēju iekļūt cilvēka šūnās. Tomēr mRNS vakcīnas netiek ražotas šūnās, to atlikušā DNS nav iegūta no saimniekšūnām, un, pats galvenais, mRNS vakcīnās esošā DNS nav kaila. Tās ir saistītas ar LNP piegādes sistēmām, kas īpaši atvieglo DNS iekļūšanu šūnās. FDA 2010. gada vadlīnijas skaidri norāda, ka tās nenosaka atbilstošu drošības slieksni DNS, kas saistīta ar LNP bāzes produktiem.
Citas bieži citētas vadlīnijas ir no PVO par rekombinantiem olbaltumvielu terapeitiskiem līdzekļiem, kas attiecas uz atlikušo DNS tādos produktos kā monoklonālās antivielas vai hormoni, kas ražoti inženierijas ceļā iegūtās šūnās. Arī šajā gadījumā atlikušā DNS rodas no saimniekšūnām vai ekspresijas plazmīdām, ir sastopama kā niecīga, neiekapsulēta DNS (kaila), un gala produkts ir attīrīts proteīns, nevis uz nukleīnskābēm balstīta terapija (mRNS vakcīna). Tāpēc šīs vadlīnijas neattiecas uz mRNS vakcīnām.
Ne FDA, ne PVO regulējošie standarti, kas visbiežāk tika minēti attiecībā uz atlikušo DNS, netika izmantoti. izstrādātas mRNS vakcīnām un tieši nerisina šo drošības problēmu.
Ko PVO teica par mRNS vakcīnām — pēc izvietošanas
2022. gadā Pasaules Veselības organizācija izdeva vadlīnijas, kas īpaši veltītas mRNS vakcīnām.7Jāatzīmē, ka šis dokuments tika publicēts pēc šo produktu globālo ieviešanu. Tajā īpaši norādīts, ka šīs vadlīnijas bija atbilde uz: “ar šo jauno tehnoloģiju saistītie drošības, ražošanas un regulējuma jautājumi.Dokumentā ir arī vairāki svarīgi apgalvojumi:
"Tā kā detalizēta informācija par ražošanā izmantotajām metodēm vēl nav pieejama, kontroles vēl nav standartizētas drošām un efektīvām mRNS vakcīnām, un noteikta informācija joprojām ir patentēta un tādējādi nav publiski pieejama, šobrīd nav iespējams izstrādāt īpašas starptautiskas vadlīnijas vai ieteikumus."
Tajā tālāk teikts: “Detalizētas ražošanas un kontroles procedūras… jāapspriež ar NRA [Valsts regulatīvo iestādi] un jāapstiprina tai.] katrā atsevišķā gadījumā."
PVO atzīst, ka mRNS vakcīnu kontrole vēl nebija standartizēta un ka nebija iespējams izstrādāt īpašas starptautiskas vadlīnijas vai ieteikumus. Turklāt ir nepieciešama regulatīvā uzraudzība, lai valsts iestādes varētu veikt atsevišķu gadījumu izvērtēšanu.
Tas tika paziņots pēc mRNS vakcīnu ieviešanas..
Un šīs apakškaudzes rakstīšanas laikā Pārtikas un zāļu pārvalde (FDA) joprojām nav izstrādājusi standartizētas vadlīnijas mRNS vakcīnām un sniegusi jebkādus pierādījumus un uz drošību balstītus datus, kas pamatotu jebkādus DNS ierobežojumus mRNS vakcīnās.
Visbeidzot, ir vērts atkārtot: lai gan mRNS tehnoloģija nav jauna, pirms Covid tā tika regulēta kā gēnu terapija, nevis kā tradicionāla vakcīna. Drošības problēmas, kas saistītas ar DNS blakusproduktiem Covid vakcīnās, būs tādas pašas kā jebkurai mRNS vakcīnai, tostarp gripas, RSV vai pat vēža mRNS vakcīnām.
Tas ir tāpēc, ka mRNS produkti ir principiāli atšķirīgi. Tiem ir jāiekļūst šūnās un jādod tām norādījumi ražot svešu olbaltumvielu. Tas atšķiras no citām tradicionālajām vakcīnām, kas olbaltumvielu piegādā tieši. Šai platformai nav klīniska precedenta, un nav klīniska precedenta atkārtotai dozēšanai. Un noteikti nav precedenta populācijas mērogā.
Šajā posmā, kad nav pandēmijas, uzkrājas mehānistiskie dati un klīniskie novērojumi, un tirgū nonāk arvien vairāk mRNS vakcīnu, mums ir nepieciešama pārredzamība un tieša iesaistīšanās nopietnos drošības pētījumos no regulatoru puses, jo īpaši no Pārtikas un zāļu pārvaldes (FDA), kas nosaka kritiskas vadlīnijas šo produktu ražošanai, īpaši attiecībā uz DNS blakusproduktiem.
Jaunām tehnoloģijām ir nepieciešama jauna veida pārbaude, nevis klusēšana, manipulācijas vai cenzūra.
Atsauces
1 https://www.frontiersin.org/journals/molecular-biosciences/articles/10.3389/fmolb.2024.1426129/full
2 Webb C, Ip S u.c. Mol Pharm. 2022. gada 4. aprīlis; 19(4):1047–1058. doi: 10.1021/
3 https://www.tandfonline.com/doi/10.1080/08916934.2025.2551517?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%20%200pubmed
4 https://www.tga.gov.au/resources/publication/tga-laboratory-testing-reports/summary-report-residual-dna-and-endotoxin-covid-19-mrna-vaccines-conducted-tga-laboratories.
5 https://zenodo.org/records/17832183; https://www.scstatehouse.gov/CommitteeInfo/SenateMedicalAffairsCommittee/PandemicPreparedness/Phillip-Buckhaults-SC-Senate-09122023-final.pdf
6 Vangs un līdzautori (2004) – “Plazmīdu DNS integrācijas noteikšana saimnieka genoma DNS pēc intramuskulāras injekcijas un elektroporācijas” (Gene Therapy, 2004). Pelēm intramuskulāri tika ievadīta kaila plazmīdu DNS, kam sekoja elektroporācija, lai uzlabotu uzņemšanu. Izmantojot ļoti jutīgu PCR attīrītai genoma DNS (ar gēla atdalīšanu, lai noņemtu ekstrahromosomālas formas), autori identificēja četrus neatkarīgus integrācijas notikumus 4 nedēļas pēc injekcijas. Savienojumu sekvencēšana apstiprināja nejaušas integrācijas vietas (bez preferenciāliem karstajiem punktiem), kas atbilst nehomologai galu savienošanai. Integrācijas biežums bija zems, bet izmērāms. Šis ir viens no skaidrākajiem faktisko spontāno integrācijas notikumu in vivo demonstrējumiem kailai plazmīdu DNS muskuļos. Jāatzīmē, ka šajā pētījumā tika izmantota uzlabota DNS piegāde, izmantojot elektroporāciju, ko varētu salīdzināt ar uzlaboto piegādi, izmantojot LNP.
Martin et al. (1999) – “Plazmīdas DNS malārijas vakcīna: genomiskās integrācijas potenciāls pēc intramuskulāras injekcijas” (Cilvēka gēnu terapija). Šajā agrākajā pētījumā tika pārbaudīta plazmīdas DNS IM pelēm un integrācijas noteikšanai tika izmantota Southern blot hibridizācija un PCR ar augstas molekulmasas genomisko DNS. Lai gan noturība galvenokārt bija ekstrahromosomāla, viņi ziņoja par pierādījumiem, kas liecināja par retu integrāciju dažos paraugos (lai gan ne tik precīzi sekvencēti kā vēlākajos darbos). Tas noteica zema riska kritēriju, bet atzina ļoti zemas frekvences notikumu potenciālu, ietekmējot turpmākās FDA vadlīnijas par DNS vakcīnām.
Ledwith et al. (2000) – “Plazmīdu DNS vakcīnas: integrācijas pētījums saimniekšūnu DNS pēc intramuskulāras injekcijas pelēm” (Intervirology). Kaila plazmīdu DNS, kas injicēta intramuskulāri pelēm, uzrādīja, un, lai gan netika novērota nosakāma integrācija, DNS joprojām tika konstatēta četrgalvu muskulī līdz pat 26 nedēļām. DNS bija ekstrahromosomāla.
7 PVO Bioloģiskās standartizācijas ekspertu komitejas 74. ziņojuma 3. pielikums. Ziņnesības RNS vakcīnu kvalitātes, drošības un efektivitātes novērtējums infekcijas slimību profilaksei: normatīvie apsvērumi https://cdn.who.int/media/docs/default-source/biologicals/vaccine-standardization/annex-3—mrna-vaccines_who_trs_1039_web-2.pdf
Dr. Šarlote Kūpervasere ir izcila profesore Taftsas Universitātes Medicīnas skolas Attīstības, molekulārās un ķīmiskās bioloģijas katedrā un Taftsas Universitātes Konverģences laboratorijas direktore. Dr. Kūpervasere ir starptautiski atzīta par savu pieredzi piena dziedzeru bioloģijā, krūts vēža un profilakses jomā. Viņa ir Imunizācijas prakses padomdevējas komitejas locekle.
